Pasivní vzorkování a aplikace necílené LC HRMS analýzy pro identifikaci nových emergentních látek v povrchových vodách

Cílená analýza „tradičních“ mikropolutantů realizovaná v rámci monitorovacích studií nezachytí všechny problematické sloučeniny přítomné v povrchové vodě, která je používána pro závlahy. Pomocí necílené analýzy pasivních vzorkovačů s použitím vysoko-rozlišující hmotnostní spektrometrie bylo identifikováno 164 sloučenin přítomných v Labi a jeho přítoku Jizeře. 103 z nich bylo detekováno na všech čtyřech vzorkovaných lokalitách. Mezi sloučeniny s nejvyšší odezvou patří nejen léčiva, pesticidy a jejich metabolity, ale i průmyslové kontaminanty a látky používané v domácnostech.

Úvod

Probíhající klimatické změny vedou k častějšímu výskytu extrémních jevů. Sucho, ať již soustavné nebo pouze periodické, je jedním z nich a může výrazně ovlivňovat zemědělskou produkci. V úrodných oblastech ČR jsou k závlahám polí využívány povrchové vody, jejichž množství, ale také kvalita jsou suchem ovlivněny. Český hydrometeorologický ústavu (ČHMÚ) a podniky Povodí monitorují hladiny kontrolovaných polutantů v tocích, které jsou z pohledu závlah významné. Jednou z používaných metod je i pasivní vzorkování, kdy jsou různé typy pasivních vzorkovačů exponovány in situ po dobu 2–3 týdnů. V průběhu expozice pasivního vzorkovače dochází k přestupu látek z vodního prostředí do vzorkovače. Jedná se o samovolný difúzní proces, který je podmíněn rozdílem chemické aktivity monitorované látky mezi vzorkovaným médiem (povrchovou vodou) a sorpční fází pasivního vzorkovače. Akumulované látky se poté z pasivního vzorkovače vyextrahují a v extraktu se stanoví jejich koncentrace – [2]. Výsledkem pasivního vzorkování je celkové kumulované množství dané sloučeniny, které může být přepočteno na časově vážený průměr koncentrace ve vzorkovaném období. Pasivní vzorkování tedy reprezentuje podstatně delší časový úsek než bodové odběry vody nebo i 24hodinové slévané vzorky.

Sledování kvality vod podle Rámcové směrnice EU [4] je založeno na analýzách několika desítek prioritních sloučenin, které byly identifikovány jako nebezpečné či potencionálně nebezpečné látky. Většinou se proto v rámci monitoringu sledují tradiční polutanty, jako jsou např. léčiva a jejich metabolity, pesticidy a jejich metabolity, per- a polyfluorované látky (PFAS). Avšak analýzou i několika stovek těchto analytů získáme informace pouze o malé části sloučenin obsažených ve vzorku.

Aplikace metod necíleného screeningu na bázi vysokorozlišující hmotnostní spektrometrie (HRMS) je stále více využívaným nástrojem pro identifikaci cizorodých látek přítomných v komplexních směsích, jako jsou kontaminované povrchové vody [5, 7]. Pomocí nových vzorkovacích (pasivní vzorkovače) a analytických metod (HRMS) jsme schopni detekovat až desítky tisíc signálů v těchto vzorcích. Pro zúžení počtu signálů (potenciálních sloučenin) na ty, které jsou relevantní pro finální identifikaci, byly vyvinuty postupy založené na různých principech [5]. Jedním z nich je diferenční analýza potenciálně kontaminovaných vzorků, se vzorky s velmi nízkou úrovní zatížení [6]. K tomuto vyhodnocení je potřeba nákladné programové vybavení, výkonná výpočetní technika a hlavně zkušený personál. I když je vlastní vyhodnocení získaných dat pomalé, jsme schopni těmito metodami hledat a stanovit vlastní relevantní parametry pro monitoring znečištění vodního prostředí a s ním související hodnocení rizik.

ČHMÚ využívá pro monitoring i pasivní vzorkovače typu POCIS (Polar Organic Chemical Integrative Sampler), které byly použity v této studii. Naším cílem bylo identifikovat emergentní cizorodé látky přítomné v povrchových vodách Polabí pomocí kapalinové chromatografie s vysokorozlišující hmotnostní spektrometrií (LC-HRMS) s využitím necíleného screeningu.

Metodika

Pasivní vzorkovače typu POCIS (Pharm varianta – sorbent Oasic HLB, Affinisep) byly v rámci pravidelného monitoringu ČHMÚ na jaře 2023 instalovány na čtyři lokality v Polabí, které jsou z pohledu množství odebíraných závlah významné. Jednalo se o Labe-Hradec Králové, Labe-Lysá n. L., Labe-Obříství a jeho přítok Jizera-Předměřice (obr. 1). Pasivní vzorkovače byly po 21denní expozici převezeny do laboratoře, kde byly uloženy při -20 °C až do jejich extrakce, která byla provedena podle metodiky [1]. Pasivní vzorkovač byl rozebrán, sorbent byl kvantitativně převeden do extrakční kolonky, vyextrahován metanolem a extrakt byl odpařen na 1 ml. Alikvot 250 µl byl odebrán pro analýzu, byly přidány isotopicky značené vnitřní standardy a vzorek byl analyzován pomocí kapalinové chromatografie. Pro cílenou analýzu léčiv a jejich metabolitů, pesticidů a jejich metabolitů byl použit hmotnostní spektrometr s trojitým kvadrupólem (TSQ Quantiva, Thermo Fisher Scientific, USA). Detaily analýz, jako jsou mobilní fáze, analytická kolony, délka analýz či MSMS přechody, jsou uvedeny např. v publikaci [12]. Pro necílenou analýzu byl využit hybridní hmotnostní spektrometr (kvadrupól s orbitální iontovou pastí) QExactive HF (Thermo Fisher Scientific). Sběr dat probíhal v módu kombinace plného skenu s DIA (data independent aquisition), odděleně pro pozitivní a negativní ionizaci. Více informací o analytické metodě lze nalézt v publikaci [9].

Data z cílené analýzy byla zpracována pomocí softwaru Trace Finder 4.1 (Thermo Fisher Scientific), data z necílené analýzy pak softwarem Compound Discoverer 3.3 (Thermo Fisher Scientific).

Obr. 1. Mapa oblastí zavlažovaných povrchovou vodou s vyznačenými místy instalace pasivních vzorkovačů. 1. Labe-Hradec Králové, 2. Labe-Lysá n. L., 3. Labe-Obříství, 4. Jizera-Předměřice

Výsledky a diskuze

V extraktech pasivních vzorkovačů bylo cíleně analyzováno 91 léčiv a jejich metabolitů, 104 pesticidy a jejich metabolity a tři benzotriazoly. Na lokalitě Labe-Hradec Králové dosahovala celková koncentrace těchto sloučenin hodnoty 1 600 ng·POCIS^-1 a nad limitem kvantifikace bylo detekováno 43 léčiv, 10 metabolitů léčiv, 32 pesticidů, 22 metabolitů pesticidů a tři benzotriazoly (obr. 2). Nejvíce zastoupenou skupinou na této lokalitě byla léčiva. Na lokalitách Labe‑Lysá a Labe‑Obříství došlo ke zvýšení celkové koncentrace na hodnotu 6 000 ng·POCIS^-1. Také profil jednotlivých skupin byl oproti lokalitě Labe-Hradec Králové odlišný – podíl pesticidů a benzotriazolů na celkovém zatížení se zvýšil, ale nejvíce zastoupenou skupinou zůstala léčiva. Na lokalitě Jizera-Předměřice dosáhla celková koncentrace těchto cizorodých látek hodnoty 2 800 ng·POCIS^-1, opět nejvíce zastoupenou skupinou (koncentračně i počtem pozitivních záchytů) byla léčiva. Jizera se do Labe vlévá mezi lokalitami Lysá a Obříství, proto by se dal předpokládat nárůst celkové koncentrace na lokalitě Labe-Obříství. Avšak vzhledem k relativně velkému naředění došlo jen k nepatrnému zvýšení celkové koncentrace na této lokalitě v porovnání s Labem v Lysé n. L.

Obr. 2. Celková koncentrace léčiv, pesticidů a jejich metabolitů v pasivních vzorkovačích, data z cílené analýzy. Čísla nad sloupci značí počet pozitivních nálezů léčiv / metabolitů léčiv / pesticidů / metabolitů pesticidů / benzotriazolů z celkem 79 / 12 / 71 / 34 / 3 stanovovaných

Zpracováním dat z necílené analýzy se podařilo identifikovat 164 sloučeniny, které byly potvrzeny buď porovnáním se standardem [10], nebo porovnáním s knihovnou hmotnostních spekter [10]. 65 z nich patří do skupiny léčiv a jejich metabolitů, 55 mezi pesticidy a jejich metabolity, dále byly identifikovány čtyři PFAS, 14 povrchově aktivních látek, šest organofosforových zpomalovačů hoření, čtyři benzotriazoly, pět derivátů nitrofenolu, pět dalších dusíkatých látek a posledních šest sloučenin nepatří do žádné z výše zmíněných skupin (obr. 3). Analýza hlavních komponent (PCA) znázorňuje kvalitativní rozdíly mezi čtyřmi vzorkovanými lokalitami podle úrovně kontaminace (faktor 1) – lokality Labe-Lysá a Labe-Obříství tvoří jednu skupinu, Labe-Hradec Králové a Jizera-Předměřice skupinu druhou (obr. 4). Většina sloučenin s vyšší odezvou (plochou píku) byla nalezena na dolním toku Labe (Labe-Lysá a Labe-Obříství). Faktor 2 pak představuje specifické zatížení typické pro dané vzorkované místo. Klastrová analýza, která slouží k doplnění PCA, ukázala stejné rozdělení lokalit podle sloučenin ionizujících v pozitivním i negativním módu – Labe-Lysá + Labe-Obříství, Labe-Hradec Králové + Jizera-Předměřice (obr. 5).

Obr. 3. Počet sloučenin identifikovanyých na základě dat z necílené analýzy na Schymanski úrovni 1 (potvrzeno analýzou standardu) a 2 (shoda s knohovnou MSMS spekter) – detaily v Schymanski a kol., 2014. PFAS – per- a polyfluorované sloučeniny, OPFR – organofosforové zpomalovače hoření

Obr. 4. Analýza hlavních komponent datového souboru 164 sloučenin identifikovaných na základě dat z necílené analýzy

Obr. 5. Shluková analýza (kvadrát Euklidovské vzdálenost objektů, metoda nejvzdálenějších shluků) datového souboru 164 sloučenin identifikovaných na základě dat z necílené analýzy. Růžové pozadí znamená, že sloučenina nebyla v dané lokalitě detekována

Nejvíce identifikovaných látek bylo detekováno v lokalitě Labe-Obříství (153), pak v Labi-Lysé (149), Jizeře-Předměřicích (120) a nejméně v Labi-Hradci Králové (117 sloučenin, obr. 6). Na obr. 6 je znázorněn překryv polutantů mezi sledovanými profily pomocí Vennova diagramu. Na všech čtyřech lokalitách bylo nalezeno 103 sloučenin. Po použití stejného rozdělení do skupin podle původu 44 z těchto sloučenin patří mezi léčiva a jejich metabolity, 21 mezi pesticidy a jejich metabolity, čtyři byly PFAS a 34 může být zařazeno mezi průmyslové kontaminanty (14 povrchově aktivních látek, čtyři organofosforové zpomalovače hoření, čtyři benzotriazoly, čtyři deriváty nitrofenolu, tři jiné dusíkaté látky a čtyři ostatní, obr. 7).

Obr. 6. Vennův diagram s počty identifikovaných sloučenin na jednotlivých vzorkovaných lokalitách a průniky sloučenin mezi vzorkovanými lokalitami, data z necílené analýzy

Obr. 7. Rozdělení 103 identifikovaných sloučenin nalezených na všech čtyřech vzorkovaných lokalitách, data z necílené analýzy

Protože se tyto 103 sloučeniny našly na všech čtyřech vzorkovaných lokalitách, představují tyto látky relevantní zatížení z hlediska zavlažování a jejich možného přestupu do půd a podzemních vod. V porovnání s obr. 3 došlo ke zvýšení podílu méně sledovaných nebo zatím neznámých polutantů, jako jsou průmyslové látky a látky pocházející z domácností – povrchově aktivní látky, organofosforové zpomalovače hoření či benzotriazoly, které většinou nejsou součástí běžné cílené analýzy při zadávaných monitoringových měřeních. Na obr. 8 jsou uvedeny sloučeniny podle jejich klesající odezvy. Mezi sloučeniny s nejvyšší odezvou (což nemusí korelovat s nejvyšší koncentrací, protože každá sloučenina ionizuje jinak a plocha píku není shodná s koncentrací) patří léčiva a jejich metabolity (kardiovaskulární léčivo telmisartan, léčivo na léčbu HIV/AIDS azidothymidin, metabolit analgetika metamizolu 4-acetamidoantipyrin, psychoaktivní léčiva tiaprid, tramadol, lamotrigin a metabolit venlafaxinu N-desmethylvenlafaxin), pesticidy (fungicid azoxystrobin) či prostředky denní péče (odpuzovač hmyzu DEET), ale i průmyslové (N,N‘-diphenylguanidin, hexamethoxymethyl melamin, diphenylsulfone, tris(2-butoxyethyl) fosfát) a povrchově aktivní látky (lineární alkylbenzen sulfonáty – LAS s 10 až 12 uhlíky). Posledně uvedená skupina sloučenin je vysoce relevantní i z pohledu vlivu na živé organismy. LAS s 10 až 12 uhlíky byly identifikovány jako sloučeniny s nově popsanými endokrinními účinky [8].

Obr. 8. 103 sloučenin identifikovaných na základě dat z necílené analýzy nalezených na všech vzorkovaných lokalitách seřazených podle odezvy (plochy píku). LAS – lineární alkylbenzen sulfonáty

Závěr

V rámci monitoringu cizorodých látek v povrchových vodách jsou sledovány koncentrace tradičních polutantů, jako jsou např. léčiva a jejich metabolity, pesticidy a jejich metabolity či per- a polyfluorované sloučeniny. Tyto látky ale zdaleka nemusí být přítomny v nejvyšších koncentracích a nemusí být nejvíce nebezpečné pro životní prostředí, proto je potřeba monitoring rozšířit i o další skupiny nových emergentních polutantů. K tomu může posloužit necílená analýza pomocí LC-HRMS. I přesto, že odezva (plocha píku) jednotlivých sloučenin nemusí korelovat s koncentrací, je to jeden z parametrů, společně s frekvencí detekce, pro prioritizaci látek určených pro další výzkum.

Poděkování: Tato studie byla finančně podpořena Ministerstvem zemědělství ČR, v rámci projektu Země II, NAZV, projekt číslo QK23020018.

Literatura/References

Ing. Kateřina Grabicová, Ph.D.¹⁾
Ing. Helena Švecová, Ph.D.¹⁾
Mgr. Vít Kodeš, Ph.D.²⁾
doc. Mgr. Roman Grabic, Ph.D.¹⁾

¹⁾ Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích
Fakulta rybářství a ochrany vod
Jihočeské výzkumné centrum akvakultury
a biodiverzity hydrocenóz
Zátiší 728/II
389 25 Vodňany
grabicova()frov.jcu.cz

²⁾ Český hydrometeorologický ústav
Odbor jakosti vody
Na Šabatce 17
143 06 Praha 4